هذه المقالة يتيمة. ساعد بإضافة وصلة إليها في مقالة متعلقة بها

إنتاج البروتين

من ويكيبيديا، الموسوعة الحرة
اذهب إلى التنقل اذهب إلى البحث
العقيدة المركزية التي تصور النسخ من كود الحمض النووي إلى كود الحمض النووي الريبي إلى البروتينات في الخطوة الثانية التي تغطي إنتاج البروتين.

إنتاج البروتين هي تقانة حيوية لتوليد بروتين معين. يُحقَّق عادةً عن طريق التلاعب بالتعبير الجيني في كائن حي بحيث يعبر عن كميات كبيرة من حمض نووي معاد التركيب. يتضمن ذلك نسخ الحمض النووي معاد التركيب إلى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، وترجمة الحمض النووي الريبوزي الرسول إلى سلاسل متعددة الببتيد، والتي تُطوى في النهاية إلى بروتينات وظيفية ويمكن توجيه البروتين لمواقع محددة تحت خلوية أو خارج خلوية.[1]

تُستخدم أنظمة إنتاج البروتين (المعروفة أيضًا باسم أنظمة التعبير) في علوم الحياة والتكنولوجيا الحيوية والطب. تستخدم أبحاث البيولوجيا الجزيئية العديد من البروتينات والإنزيمات، وكثير منها من أنظمة التعبير؛ بشكل خاص بوليميريز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين لـتفاعل البوليمراز المتسلسل، النسخ العكسي لتحليل الحمض النووي الريبوزي، إنزيمات الاقتطاع للاستنساخ، ولصنع البروتينات التي تُفحص في اكتشاف الأدوية كأهداف بيولوجية أو كأدوية محتملة بحد ذاتها. هناك أيضًا تطبيقات مهمة لأنظمة التعبير في التخمر الصناعي، ولا سيما إنتاج الأدوية الحيوية مثل الأنسولين البشري لعلاج مرض السكري، وتصنيع الإنزيمات.

أنظمة إنتاج البروتين[عدل]

تشمل أنظمة إنتاج البروتين المستخدمة بشكل شائع تلك المشتقة من البكتيريا،[2] الخميرة،[3][4] الفيروس البكتيري/الحشرات،[5] خلايا الثدييات،[6][7] ومؤخرًا الفطريات الخيطية.[8] عندما تُنتَج المستحضرات الصيدلانية الحيوية باستخدام أحد هذه الأنظمة، فإن الشوائب المرتبطة بالعملية المسماة بروتينات الخلية المضيفة تصل أيضًا إلى المنتج النهائي بكميات ضئيلة.[9]

الأنظمة المستندة إلى الخلية[عدل]

تعتمد أنظمة التعبير الأقدم والأكثر استخدامًا على الخلايا ويمكن تعريفها على أنها "مزيج من ناقل العبارة، وحمضه النووي المستنسخ، والمضيف للناقل الذي يوفر سياقًا للسماح بوظيفة الجين الأجنبي في خلية مضيفة، والذي هو إنتاج بروتينات على مستوى عالٍ".[10][11] الإفراط في التعبير هو مصطلح يشير إلى مستوى مرتفع بشكل غير طبيعي ومفرط من التعبير الجيني الذي ينتج عنه نمط ظاهري مرتبط بالجين.[12][13]

هناك العديد من الطرق لإدخال حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين غريب إلى خلية للتعبير، ويمكن استخدام العديد من الخلايا المضيفة المختلفة للتعبير- لكل نظام تعبير مزايا ومسؤوليات مميزة. عادةً ما يُشار إلى أنظمة التعبير من قبل المضيف ومصدر الحمض النووي أو آلية توصيل المادة الجينية. على سبيل المثال، العوائل الشائعة هي البكتيريا (مثل البكتيريا الإشريكية القولونية، والعصوية الرقيقةوالخميرة (مثل السكيراء الجعوية أو فطريات الخميرة [4]) أو سلالات الخلايا حقيقية النواة. مصادر الحمض النووي وآليات التوصيل الشائعة هي الفيروسات (مثل الفيروس العصوي والفيروسات القهقرية والفيروسات الغدية) والبلازميدات والكروموسومات الاصطناعية والعاثية (مثل لامدا). يعتمد أفضل نظام تعبير على الجين المعني، على سبيل المثال، غالبًا ما يُفضل السكيراء الجعوية للبروتينات التي تتطلب تعديلًا كبيرًا بعد الترجمة. تُستخدم خطوط الخلايا الحشرية أو الثديية عند الحاجة إلى قطْع يشبه القطْع الذي يحصل في خلايا الإنسان. ومع ذلك، فإن التعبير البكتيري يتميز بسهولة بإنتاجه كميات كبيرة من البروتين، وهو أمر ضروري لتصوير البلورات بالأشعة السينية أو تجارب الرنين المغناطيسي النووي للتحديد الهيكلي.

نظرًا لأن البكتيريا بدائيات النوى، فهي غير مجهزة بالآلية الأنزيمية الكاملة لتحقيق التعديلات المطلوبة بعد الترجمة أو الطي الجزيئي. ومن ثم، فإن البروتينات حقيقية النواة متعددة المجالات التي يُعبّر عنها في البكتيريا غالبًا ما تكون غير وظيفية. أيضًا، تصبح العديد من البروتينات غير قابلة للذوبان كأجسام متضمنة يصعب استردادها دون عوامل تغيير طبيعة قاسية وما تلاه من إعادة طيّ البروتين المستهلك.

لمعالجة هذه المخاوف، طوِّرت أنظمة التعبيرات باستخدام العديد من الخلايا حقيقية النواة للتطبيقات التي تتطلب تطابق البروتينات كما هو الحال في الكائنات حقيقية النواة أو أقرب إليها: تُنقل خلايا النباتات (مثل التبغ) أو الحشرات أو الثدييات (مثل الأبقار) مع الجينات ومزروعة في المعلق وحتى الأنسجة أو الكائنات الحية الكاملة، لإنتاج بروتينات مطوية بالكامل. ومع ذلك، فإن أنظمة التعبير عن الثدييات في الجسم الحي لها عائد منخفض وقيود أخرى (تستغرق وقتًا طويلاً، وسمية للخلايا المضيفة، …). للجمع بين الغلة/الإنتاجية العالية وميزات البروتين القابلة للتطوير للبكتيريا والخميرة، والميزات اللاجينية المتقدمة للنباتات والحشرات وأنظمة الثدييات، طوّرت أنظمة إنتاج البروتين الأخرى باستخدام حقيقيات النوى أحادية الخلية (أي خلايا "ليشمانيا" غير المسببة للأمراض).

الأنظمة البكتيرية[عدل]

الإشريكية القولونية[عدل]
E. coli ، أحد أكثر العوائل شهرة للتعبير الجيني الاصطناعي

تعتبر الإشريكية القولونية (E. coli ) واحدة من أكثر مضيفات التعبير استخدامًا، وعادةً ما يُدخَل الحمض النووي في ناقل التعبير البلازميدي. طوِّرت تقنيات الإفراط في التعبير في الإشريكية القولونية بشكل جيد وتعمل عن طريق زيادة عدد نسخ الجين أو زيادة قوة الارتباط لمنطقة المحفز، مما يساعد على النسخ.

على سبيل المثال، يمكن استنساخ تسلسل حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين لبروتين ذي أهمية أو استنساخه جزئيًا في بلازميد ذي رقم نسخ مرتفع يحتوي على محفز lac (غالبًا LacUV5)، والذي يُحوَّل بعد ذلك إلى بكتيريا E. coli. تعمل إضافة تناظرية اللاكتوز على تنشيط محفز اللاكتوز (lac) ويسبب البكتيريا للتعبير عن البروتين الفائدة.

سلالة الإشريكية القولونية BL21 وBL21 (DE3) سلالتان تستخدمان بشكل شائع لإنتاج البروتين. كأعضاء في سلالة B، فإنهم يفتقرون إلى البروتياز Lon وOmpT، مما يحمي البروتينات المنتجة من التدهور. يوفر طليعة العاثية الموجود في BL21 (DE3) بوليميريز تي 7 بوليميراز الحمض النووي الرايبوزي (مدفوعًا بمحفز LacUV5)، مما يسمح باستخدام نواقل مع محفز T7 بدلاً من ذلك.[14]

الوتدية[عدل]

تستخدم الأنواع غير المسببة للأمراض من الوتديات موجبة الجرام للإنتاج التجاري للأحماض الأمينية المختلفة. تُستخدم أنواع الوتدية الجلوتاميك على نطاق واسع لإنتاج الغلوتامات والليسين،[15] ومكونات أغذية الإنسان وعلف الحيوانات والمنتجات الصيدلانية.

عُبِرَ عن عامل نمو البشرة البشري النشط وظيفيًا في وتدية الجلوتاميك،[16] مما يدل على إمكانية الإنتاج على نطاق صناعي للبروتينات البشرية. يمكن استهداف البروتينات المعبر عنها للإفراز إما من خلال المسار الإفرازي العام (Sec) أو مسار الانتقال التوأم أرجينين (Tat).[17]

على عكس البكتيريا سالبة الجرام، تفتقر الوتدية موجبة الجرام إلى عديدات السكاريد الدهنية التي تعمل كسموم داخلية مستضدية في البشر.

زائفة متألقة[عدل]

تُستخدم البكتيريا غير الممرضة وسالبة الجرام، زائفة متألقة، لإنتاج البروتينات المؤتلفة عالية المستوى؛ عادة لتطوير المداواة الحيوية واللقاحات. الزائفة المتألقة هو كائن حي متعدد الاستخدامات من الناحية الأيضية، مما يسمح بفحص الإنتاجية العالية والتطور السريع للبروتينات المعقدة. تشتهر الزائفة المتألقة بقدرتها على إنتاج عيارات عالية من البروتين النشط والقابل للذوبان بشكل سريع وناجح.[18]

أنظمة حقيقية النواة[عدل]

الخميرة[عدل]

تسمح أنظمة التعبير التي تستخدم إما سكيراء جعوية أو Pichia pastoris بإنتاج مستقر ودائم للبروتينات التي تُعالج بشكل مشابه لخلايا الثدييات، بإنتاجية عالية، في وسائط محددة كيميائيًا من البروتينات.

الفطريات الخيطية[عدل]

لقد طُورت الفطريات الخيطية، خاصة الرشاشيات والتريكوديرما، ولكن مؤخرًا طورت Myceliophthora thermophila C1[8] إلى منصات تعبير لفحص وإنتاج الإنزيمات الصناعية المتنوعة. يُظهر نظام التعبير C1 مورفولوجيا منخفضة اللزوجة في الثقافة المغمورة، مما يتيح استخدام وسائط النمو والإنتاج المعقدة.

الخلايا المصابة بفيروس باكولوفيروس[عدل]

تسمح الخلايا الحشرية المصابة بفيروس باكولوفيروس[19] (Sf9 ، Sf21 ، خمسة سلالات عالية) أو خلايا الثدييات[20] (خلايا هيلا، و خلايا HEK 293) بإنتاج بروتينات غشائية أو غليكوزيلات لا يمكن إنتاجها باستخدام أنظمة فطرية أو بكتيرية.[19] يفيد في إنتاج البروتينات بكميات عالية. لا ييُعبّر عن الجينات بشكل مستمر لأن الخلايا المضيفة المصابة تتلاشى في النهاية وتموت خلال كل دورة عدوى.[21]

تعبير خلية حشرية غير ليتي[عدل]

يُعد التعبير عن خلية الحشرات غير اللايتية بديلاً لنظام التعبير عن فيروس باكولوفيروس. في التعبير غير الليتي، تنقل النواقل بشكل عابر أو ثابت إلى الحمض النووي الصبغي لخلايا الحشرات من أجل التعبير الجيني اللاحق.[22][23] ويتبع ذلك اختيار وفحص الحيوانات المستنسخة المؤتلفة.[24] استُخدِام النظام غير اللاحلالي لإعطاء إنتاجية أعلى للبروتين وتعبير أسرع عن الجينات المؤتلفة مقارنة بالتعبير الخلوي المصاب بالفيروس البكتيري.[23] خطوط الخلايا المستخدمة لهذا النظام تشمل: Sf9 ،Sf21 من خلايا دودة الحشد الخريفية، Hi-5 من خلايا وبير الملفوف، وخلايا Schneider 2 وخلايا Schneider 3 من خلايا ذبابة فاكهة شائعة.[22][24] مع هذا النظام، لا تتلاشى الخلايا ويمكن استخدام العديد من طرق الزراعة.[22] بالإضافة إلى ذلك، عمليات إنتاج البروتين قابلة للتكاثر.[22][23] يعطي هذا النظام منتجًا متجانسًا.[23] عيب هذا النظام هو الحاجة إلى خطوة فرز إضافية لاختيار الحيوانات المستنسخة القابلة للحياة.[24]

طلائعيات كهفية[عدل]

تسمح أنظمة تعبير ليشمانيا (لا يمكن أن تصيب الثدييات) بإنتاج مستقر ودائم للبروتينات بإنتاجية عالية، في وسائط محددة كيميائيًا. تُظهر البروتينات المُنتجة تعديلات ما بعد الترجمة حقيقية النواة بالكامل، بما في ذلك الارتباط بالجليكوزيل وتشكيل رابطة ثنائي كبريتيد.

أنظمة الثدييات[عدل]
  • أنظمة التعبير الأكثر شيوعًا للثدييات هي خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) وخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK).[25][26][25]
  • خلية مبيض الهامستر الصيني[26]
  • الورم اللمفاوي النخاعي الفأر (على سبيل المثال خلية NS0)[25]
  • إنسان كامل
    • خلايا الكلى الجنينية البشرية[26]
    • خلايا الشبكية الجنينية البشرية[26]
    • خلايا السلى البشرية

أنظمة خالية من الخلايا[عدل]

تُنتج البروتينات الخالية من الخلايا في المختبر باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي المنقى، والريبوسومات، والحمض النووي الريبوزي الناقل، والنيوكليوتيدات الريبية. يمكن إنتاج هذه الكواشف عن طريق الاستخراج من الخلايا أو من نظام التعبير القائم على الخلية. نظرًا لانخفاض مستويات التعبير والتكلفة العالية للأنظمة الخالية من الخلايا، تُستخدم الأنظمة القائمة على الخلايا على نطاق واسع.[26]

انظر أيضًا[عدل]

مراجع[عدل]

  1. ^ "Protein production and purification". Nature Methods. 5 (2): 135–46. February 2008. doi:10.1038/nmeth.f.202. PMC 3178102. PMID 18235434. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)صيانة CS1: عرض-المؤلفون (link)
  2. ^ "Recombinant protein expression in Escherichia coli". Current Opinion in Biotechnology. 10 (5): 411–21. October 1999. doi:10.1016/s0958-1669(99)00003-8. PMID 10508629. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  3. ^ "Recombinant protein expression in Pichia pastoris". Molecular Biotechnology. 16 (1): 23–52. September 2000. doi:10.1385/MB:16:1:23. PMID 11098467. S2CID 35874864. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  4. أ ب "Protein production in Saccharomyces cerevisiae for systems biology studies". Methods in Systems Biology. Methods in Enzymology. 500. 2011. صفحات 197–212. doi:10.1016/B978-0-12-385118-5.00011-6. ISBN 9780123851185. PMID 21943899. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  5. ^ "Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells". Nature Biotechnology. 23 (5): 567–75. May 2005. doi:10.1038/nbt1095. PMC 3610534. PMID 15877075. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  6. ^ "Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system". Protein Expression and Purification. 40 (2): 237–43. April 2005. doi:10.1016/j.pep.2004.07.015. PMID 15766864. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  7. ^ "A bicistronic baculovirus vector for transient and stable protein expression in mammalian cells". Analytical Biochemistry. 380 (1): 146–8. September 2008. doi:10.1016/j.ab.2008.05.020. PMID 18541133. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  8. أ ب Visser, Hans; Joosten, Vivi; Punt, Peter J.; Gusakov, Alexander V.; Olson, Phil T.; Joosten, Rob; et al. (June 2011). "Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1". Industrial Biotechnology. 7 (3): 214–223. doi:10.1089/ind.2011.7.214. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  9. ^ Wang, Xing; Hunter, Alan K.; Mozier, Ned M. (2009-06-15). "Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment". Biotechnology and Bioengineering (باللغة الإنجليزية). 103 (3): 446–458. doi:10.1002/bit.22304. ISSN 0006-3592. PMID 19388135. S2CID 22707536. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  10. ^ "Definition: expression system". Online Medical Dictionary. Centre for Cancer Education, University of Newcastle upon Tyne: Cancerweb. 1997-11-13. مؤرشف من الأصل في 21 ديسمبر 2008. اطلع عليه بتاريخ 10 يونيو 2008. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  11. ^ "Expression system - definition". Biology Online. Biology-Online.org. 2005-10-03. مؤرشف من الأصل في 25 يونيو 2018. اطلع عليه بتاريخ 10 يونيو 2008. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  12. ^ "overexpression". Oxford Living Dictionary. Oxford University Press. 2017. مؤرشف من الأصل في 20 أكتوبر 2018. اطلع عليه بتاريخ 18 مايو 2017. The production of abnormally large amounts of a substance which is coded for by a particular gene or group of genes; the appearance in the phenotype to an abnormally high degree of a character or effect attributed to a particular gene. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  13. ^ Jeong, H; Barbe, V; Lee, CH; Vallenet, D; Yu, DS; Choi, SH; Couloux, A; Lee, SW; Yoon, SH; Cattolico, L; Hur, CG; Park, HS; Ségurens, B; Kim, SC; Oh, TK; Lenski, RE; Studier, FW; Daegelen, P; Kim, JF (11 December 2009). "Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3)". Journal of Molecular Biology. 394 (4): 644–52. doi:10.1016/j.jmb.2009.09.052. PMID 19786035. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  14. ^ "The transcriptional regulatory repertoire of Corynebacterium glutamicum: reconstruction of the network controlling pathways involved in lysine and glutamate production". Journal of Biotechnology. 149 (3): 173–82. September 2010. doi:10.1016/j.jbiotec.2009.12.004. PMID 19963020. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  15. ^ "Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system". Protein Expression and Purification. 81 (2): 157–65. February 2012. doi:10.1016/j.pep.2011.09.010. PMID 21968453. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  16. ^ "Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria". Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (3): 633–42. September 2007. doi:10.1007/s00253-007-0934-8. PMID 17453196. S2CID 6238466. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  17. ^ "Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins". Glycoconjugate Journal. 16 (2): 109–23. February 1999. doi:10.1023/A:1026488408951. PMID 10612411. S2CID 34863069. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  18. ^ "Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells". Current Opinion in Biotechnology. 10 (5): 428–33. October 1999. doi:10.1016/S0958-1669(99)00005-1. PMID 10508635. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  19. أ ب "Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes". Journal of Biotechnology. 127 (3): 335–47. January 2007. doi:10.1016/j.jbiotec.2006.07.012. PMID 16959350. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  20. ^ Dyring, Charlotte (2011). "Optimising the drosophila S2 expression system for production of therapeutic vaccines". BioProcessing Journal. 10 (2): 28–35. doi:10.12665/j102.dyring. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  21. ^ "Comparison of different signal peptides for protein secretion in nonlytic insect cell system". Analytical Biochemistry. 359 (1): 45–53. December 2006. doi:10.1016/j.ab.2006.09.003. PMID 17046707. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  22. أ ب ت ث "Stable insect cell cultures for recombinant protein production". Current Opinion in Biotechnology. 8 (5): 590–4. October 1997. doi:10.1016/s0958-1669(97)80034-1. PMID 9353223. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  23. أ ب ت ث "Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production". Biotechnology Advances. 30 (5): 1158–70. 2012-09-01. doi:10.1016/j.biotechadv.2011.08.022. PMID 21968146. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  24. أ ب ت "Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production". Current Opinion in Structural Biology. 26: 39–43. June 2014. doi:10.1016/j.sbi.2014.03.006. PMC 4766836. PMID 24721463. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  25. أ ب ت "Recombinant protein production from stable mammalian cell lines and pools". Current Opinion in Structural Biology. 38: 129–36. June 2016. doi:10.1016/j.sbi.2016.06.005. PMID 27322762. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)
  26. أ ب ت ث ج "Engine out of the chassis: cell-free protein synthesis and its uses". FEBS Letters. 588 (2): 261–8. January 2014. doi:10.1016/j.febslet.2013.10.016. PMC 4133780. PMID 24161673. الوسيط |CitationClass= تم تجاهله (مساعدة)